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・６２２・ 中国病理生理杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００８。２４（３）：６２２—６２４ ［文章编号］１０００—４７１８（２００８）０３—０６２２—０３ ・实验技术・ ＳｉＯ２与超液化碘油联合诱导的 小鼠肝脏纤维化模型 张文斌 ， 姜海平 ， 张海伟弘， 郭国庆 ， 马秀君 （暨南大学 附属第一医院急诊科， 附属第一医院肝胆外科， 医学院病理解剖教研室， 医学院解剖教研室， 医学院实验中心，广东广州５１０６３２） ［摘要］ 目的：探讨建立小鼠肝脏局部纤维化动物模型的方法及其可能机制。方法：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠２４只 随机分成３组：实验对照组（生理盐水）、碘油组（超液化碘油）、混和液组［超液化碘油＋二氧化硅（ＳｉＯ：）］，分别用 生理盐水、超液化碘油及混和液各０．２ ｍＬ局部注射小鼠右肝，３个月后观察注射局部病理变化，并比较变性坏死、 纤维化及细胞和纤维化结节的面积差异，测量血清免疫球蛋白Ｍ（ＩｇＭ）的变化。结果：３组注射局部肉眼观察无明 显差别；ＨＥ染色镜下观察，３组小鼠注射局部变性坏死面积不同，其中混和液组引起局部变性坏死面积最大（Ｐ＜ ０．０１）；混和液组与碘油组两两比较变性坏死面积无显著差异（Ｐ＞０．０５）；在混和液组可见肝脏组织局部的巨噬细 胞结节和纤维细胞增生，局部纤维细胞增生较碘油组有显著差异（Ｐ＜０．０５）；Ｍａｓｓｏｎ染色法观察，在混合液组局部 胶原纤维形成显著增多，占观察局部面积的１０．８％±１．７％（Ｐ＜０．０１）；而碘油组和对照组分别为４．８％±１．１％、 ２．３％±０．７％；３组小鼠血清ＩｇＭ水平有差异（Ｐ＜０．０１），其中，混合液组最高［（３１４．７±１０．７）ｍｇ／Ｌ］。结论：ＳｉＯ２ 与超液化碘油联合应用可以选择性诱导小鼠肝脏纤维化，同时伴发体液免疫因子ＩｇＭ的显著升高。 ［关键词］二氧化硅；肝硬化；碘化油；小鼠；免疫球蛋白Ｍ；模型，动物 ［ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ］ Ｓｉｌｉｃｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ；Ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ Ｉｏｄｉｚｅｄ ｏｉｌ；Ｍｉｃｅ；Ｉｍｍｕｎｏ￣【ｏｂｕｌｉｎ Ｍ；Ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｉｍａｌ ［中图分类号］Ｒ７３２．１ ［文献标识码］Ａ 原发性肝癌起病隐匿、临床症状不典型，确诊时往往已 本光学公司）；显微镜测微尺（１０ ｐ，ｍ）；ＬＥＩＣＡ—ＤＭＲＡ２荧光 Ｑｗｉｎ图像分析处理软件。 属中晚期，术后复发率高达６ｏ％以上，导致肝癌术后生存率 显微镜；不高…。自从开展肝动脉栓塞介入治疗（ＴＡＣＥ）中晚期病人 ２方法 将２４只Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分成３组，经腹部正中切口 以来，众学者认为ＴＡＣＥ是１种较有效的方法 Ｊ，但该方法仍 然存在一些问题。如由于肝动脉栓塞后侧枝循环的建立，降 显露小鼠肝脏右叶，用ｌｍＬ注射器３支分别抽取生理盐水 ｒｏｌ组）、超液化碘油（１ｉｐｉｄｏｌ组）及混和液（１ｏ ｍＬ超液化 低了对肿瘤抑制作用。近来临床研究发现，肝癌栓塞后局部 （ｃｏｎｔｏ２晶体５ ｍｇ，ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ组），局部注射到肝右 纤维化包膜形成好的临床疗效也较好 Ｊ。鉴此，能否选择性 碘油＋ｓｉ叶实质内（斜向左进针０．３—０．４ ｃｍ），每只注射０．２ ｍＬ，缝合 地人造肝癌局部纤维化包膜，加强介入治疗疗效，值得探讨。 切口，术后未用抗生素。在动物饲养室（ＳＰＦ）常规饲养，３个 据我们所掌握的资料，该方面研究还未见报道。本研究应用 月后处死，取小鼠肝脏常规固定，以穿刺点为中心，冠状面５ ＳｉＯ：诱导了小鼠肝脏局部纤维化，建立了局部纤维化的动物 等份切开，石蜡包埋、切片。应用ＨＥ染色观察组织形态改 模型并探讨其可能机制，可能为肝癌的基础和临床介入治疗 变，测量变性坏死（由于变性坏死交错混杂在一起，合并统计 的研究提供一条新途径。 面积）、纤维细胞增生及巨噬细胞和纤维细胞性结节的面积， 材１材料 料和方法 取最大径ａ和最小径ｂ，按公式计算面积Ｓ＝ａｂ，￣１４，每只小鼠 取不同病变总面积作为结果，判断标准按不同病变总面积分 成Ｉ级＜１×１０ 、Ⅱ级＜２×１０ ｏ，ｍ 、Ⅲ级＜３×１０ 、 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［西安实验动物中心，编号为ＳＣＸＫ（军２００２— Ⅳ级≥３×１０ ｍ ；应用Ｍａｓｓｏｎ染色法观察局部胶原纤维形 ２００５）］小鼠２４只；超液化碘油（加柏公司）；ＳｉＯ２晶体（１５— 成情况，并应用Ｑｗｉｎ软件进行图像分析；经眼静脉采血１ ２０ ｏ，ｍ）（Ｓｉｇｍａ）；Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｒｒａｙ ３６０ ｓｙｓｔｅｍ测定仪（Ｂｅｃｋ－ ｍＬ，散射比浊法测量血浆免疫球蛋白。 ｍａｎ）；Ｂｅｃｋｍａｎ原装试剂盒（Ｂｅｃｋｍａｎ）；Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜（日 ３统计学处理 【收稿日期】２００７一ｏ４－０２ ［修回日期】２００７－０７一ｌ７ ［基金项目】广东省科技计划资助项目（Ｎｏ．２００５Ｂ３０３０１０１６） △通讯作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｚｈｗ＠ｊｎｎ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com
汁量数据采用均数±标准差(x4s)表示，病变面积行秩和检验，血浆免疫蛋山和胶原纤维比较采用方差分析。结果趟液化碘油组和混和液组注射药后分别有1只出现过敏反应死亡，其余小鼠命部存活。1小鼠肝脏病理变化3组月f脏注射局部肉眼观察无差别，均可见穿刺点局部纤维黏连，以混和液组穿刺点部位最严重。镜下观察，实验对照组小引起肝}i庄变。降坏死、纤维化；混合液组穿刺局部肝Fig1Thelivel’fattydegcnetatlotlandthespot’adiellecrosis组织山现变性(脂肪样变)和液化坏死，细胞及纤维化性结lesionsinthepuncttl!’(、posilioninmixluregl’OLIp(HE，节形成×，行可见细胞内SiO：晶体穿刺以外区域可见少龄2．，炎001性细胞侵润，未见变形坏死及纤维细胞增生(图13)图1混和液组穿刺局部IK~Itt胞脂肪变性。根和局灶性坏死据病变总面积进行分级后行秩和检验，3组小鼠变性坏死面积小同。，其中混和液组引起局部变性坏死而积最大(y=15．4，P<0．01)；混和液组与碘油组两两比较变性坏死面积兀显著差异(z=一0．8，P>0．05)；碘油组和混合液组均引起肝脏纤维细胞增生，而混合液组敛肝脏纤维化较碘油组明显(z=一2．5，P<0．01)；3组中只有混合液组出现巨噬细胞及纤维细胞性结节，个别结节有早期玻璃样变倾向。见表l应用Masson染色泼观测局部胶原纤维被染成绿色(罔4A、4B)，彳F混合液组显著增多，占观察局部而积的10．8％±Fi‘g2Fhelivelifbercellh1yperplasiai11thepunetul’。positionin．7％(P<0．01)；而碘油组和埘照组分别为4．8％±1．1％、lipiodolgroup(IIE．×400)．2±．．3％0．7％，见表2．．．～图2碘油组穿刺局部肝组织纤维细胞增生乞●0●，◆．，．．．．．“+，．．．◆¨、．．．．净，”。，●、-r，。．q0．．，y0～∞0文建篷Fig3Thefmmaironofmacrophage130ds，ifbl‘ocytenodsandtheifbroeyteproliferationinthepun(~[urepositioninmixture‘gxOUp，andSiO!cDstalWaSti)undinnodsaftra’thl’eemonths(HE．A：×400；B：×620)．图3混和液组3个月后巨噬细胞结节及纤维细胞结节形成，结节内可见SiO：晶体Fig4CollagenfiberbyMassonstaininginmixturegroupafterthreemottths(Masson．A：×200；B：X200)图4混合液组3个月后局部胶原纤维形成情况维普资讯 http://www.cqvip.com
・６２４・ 表１病变面积测量结果 Ｔａｂ １ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｒｅａ ｍｅ￣ｕｒｅｍｅｍ Ｐ＜０．Ｏｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ： Ｐ＞０．０５ ｌｉｐｉｏｄｏｌ ｇｒｏｕｐ；’Ｐ＜０．０５ ｌｉｐｉｏｄｏｌ ｇｒｏｕｐ ２小鼠血清ｉｇＭ的变化 ３组小鼠血浆ＩｇＭ水平以混合液组最高达到（３１４．７± ｌ０．７）ｍｇ／Ｌ，碘油组为（１１６．０±７．２）ｍｇ／Ｌ，对照组为（５６．９± ８．２）ｍｇ／Ｌ，３组均数不同（Ｐ＜０．Ｏ１），见表２。 表２ 穿刺局部胶原纤维所占面积及血浆ｉｇＭ测量结果 Ｔａｂ ２ Ａｒｅａ ｏｃｃｕｐｉｅｄ ｂｙ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｆｂｒｅ ａｔ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｐｌａｓ— ｍａ ＩｇＭ ｌｅｖｅｌ（ ±ｓ．ｎ＝７） Ｐ＜０．０ｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． 讨 论 肝纤维化的发生、发展是肝实质细胞变性坏死和间质的 细胞活化并过量合成、分泌细胞外基质及其它因子如促纤维 形成因子共同作用的结果。Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ等 认为肝星状细胞 活化、增殖、数量增加，而使细胞外基质的合成增加是肝纤维 化形成的直接原因。肝细胞损伤以及枯否细胞介质可以激 活邻近的肝星状细胞，从而启动肝纤维化。另外，参与肝纤 维化的细胞因子如血小板源生长因子 、转化生长因子 １３ ＿６ Ｊ、白细胞介素一１【 通过不同的途径参与肝纤维化的形 成。实验证明：ＳｉＯ：可诱导吞噬细胞释放致纤维化因子，诱 导成纤维细胞异质性转化进而引起自发性肺纤维化 ，能 否引起肝脏局部纤维化未见报道。本组实验显示，碘油及碘 油与ＳｉＯ：混和液均可诱导肝脏局部变性、坏死进而引起局部 纤维细胞增生；ＳｉＯ：晶体可致独特的巨噬细胞结节、纤维细 胞结节性纤维化；并且注射局部纤维细胞增生明显优于碘 油，而穿刺外肝组织未见纤维细胞增生。有人观察在肺矽结 节形成过程中，ＳｉＯ：可以诱导矽肺的形成，这与血浆ＩｇＧ、ＩｇＭ 出现增高有关，提示体液免疫参与这一过程 ，本组血浆 ＩｇＭ的持续增高与矽肺形成的免疫研究相吻合，这提示在此 过程中还发生免疫系统的失调。本组实验显示ＳｉＯ：与超液 化碘油的联合应用可以显著地引起小鼠肝脏局部纤维细胞 增生，选择性建立了小鼠肝脏纤维化模型，这一结果可能会 为肝癌介入治疗，延长晚期肝癌病人的生存时间提供实验研 究途径。 ’ ［参考文献］ ［１］ 吴孟超，陈汗，姚晓平，等．原发性肝癌的外科治疗 ［Ｊ］．中华外科杂志，１９９６，３４（１２）：７０７—７１０． ［２］ 黎洪浩，区庆嘉，陈积圣，等．肝癌根治性切除术后联合 肝动脉化疗栓塞和门静脉化疗对预防复发的价值［Ｊ］． 中华肿瘤杂志，２０００，２２（１）：６ｌ一６３． ［３］张新力，施源，陈重，等．肝动脉栓塞介入治疗中 晚期肝癌的彩色多普勒超声影像动态观察［Ｊ］．中华 肝脏病杂志，２００３，１１（９）：５６６—５６７． ［４］ Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ Ｂ，Ｈｅｌｌｅｒｂｒａｎｄ Ｃ，Ｈｏｌｃｉｋ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｓｔｔｒａｎ— ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｏｆ ｃｏｌｌｇａｅｎ ｌａｐｈａ（１）ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｅｐａｔ— ｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃａｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，１７（９）：５２０１ —５２０９． ［５］徐永锋，管洪庚，薛万江，等．磷脂酰肌醇３（ＰＩ３Ｋ）激酶 信号途径对血小板源生长因子促肝星状细胞增殖与Ｉ 型胶原表达的影响［Ｊ］．苏州大学学报（医学版），２００６， ２６（３）：３８９—４１１． ［６］ 丁宁，李岩．转化生长因子１３ 和结缔组织生长因 子在肝纤维化中的表达［Ｊ］．世界华人消化杂志， ２００６，１４（２５）：２５２１—２５２６． ［７］ 邓存良，陈国民，余光开，等．重组人白细胞介素一１受 体拮抗剂抗肝纤维化的实验研究［Ｊ］．泸州医学院学 报，２０００，２３（４）：２５７—２６０． ［８］ 司徒锐．煤矿尘肺［Ｍ］．北京：煤炭工业出版社，１９８４． ３３３． ［９］ 毛国根，叶少菁，曾群力．二氧化硅刺激肺成纤维细胞 间隙连接功能下调的研究［Ｊ］．中华劳动卫生职业病杂 志，２００１，１９（１）：３０—３３． ［１０］林晨，杨柳，张文兴，等．裸鼠实验性矽结节形成 与免疫应答关系的探讨［Ｊ］．中国病理生理杂志， １９９５，１１（６）：６ｌ５—６１８．